مفهوم تعیین توالی

تعیین توالی DNA از مهم ترین تکنیک­های موجود در زمینه زیست شناسی مولکولی بوده که به موجب آن می­توان ترتیب قرار گرفتن نوکلئوتید­ها را در یک قطعه از DNA مشخص نمود. چندین روش مختلف جهت تعیین توالی DNA  وجود دارد که به موجب آن دانشمندان قادرند به مطالعه مستقیم ژنوم بپردازند. در حال حاضر تعیین توالی DNA  در زمینه تشخیص طبی و دیگر زمینه­های پزشکی از جایگاه ویژه­ای برخوردار می­باشد.

شکل زیر نمایی از جزئیات این روش را نشان می­دهد:

شکل 3: روش توالی یابی سنگر

توالی یابی DNA به صورت اتوماتیک و با دستگاه توالی یاب Applied Biosystems (ABI)

سیستم توالی یاب بر مبنای فلورسانس ABI، نوع پیشرفته و اصلاح شده­ای از توالی یابی دی داکسی سنگر است. به طور کلی عملکرد این سیستم اتوماتیک از مراحل نشان داده شده در شکل زیر تشکیل شده است:

شکل 4: شمایی از مراحل توالی یابی DNA به صورت اتوماتیک

در صورت رعایت موارد ذیل، امکان دستیابی به یک نتیجه توالی یابی موفق وجود دارد که نمونه­ای از این نتایج در شکل 5 به تصویر کشیده شده است.

• غلظت مناسب پرایمر و DNA الگو
• تخلیص عالی DNA و الگو
• طراحی بهینه پرایمر

شکل 5: نمونه­ای از خوانش صحیح توالی DNA

مشکلات توالی یابی DNA به صورت اتوماتیک

به منظور دستیابی به یک خوانش صحیح و موفق، می­بایستی نکاتی در نظر گرفته شود که در بخش شرایط نمونه برای تعیین توالی به تعدادی از آن­ها اشاره شد. در ادامه تعدادی از دلایل عدم دستیابی به یک نتیجه توالی یابی مطلوب ذکر شده است.

از دلایل عمده نتایج نا­مطلوب توالی یابی، کیفیت پایین نمونه ارسالی و طراحی نا­مناسب و کیفیت پایین پرایمر می­باشد.

کیفیت پایین نمونه ناشی از:

• حجم و غلظت نمونه کمتر از حد استاندارد ذکر شده (به دلیل نشتی و تبخیر)
• عدم تخلیص مناسب محصول و وجود مهار کننده­های PCR
• وجود ساختار­های ثانویه و تکرار­های مونونوکلئوتیدی

کیفیت پایین پرایمر ناشی از:

• حجم و غلظت پرایمر کمتر از حد استاندارد ذکر شده (به دلیل نشتی و تبخیر)
• طراحی و سنتز نا­مطلوب
• اتصال غیر­اختصاصی

نمونه­هایی از نتایج توالی یابی نا­موفق

1-عدم انجام واکنش­های توالی یابی DNA به دلیل کیفیت نا­مطلوب نمونه

2- وجود نویز در پس زمینه توالی­ها به دلیل کیفیت نا­مناسب نمونه

3- کاهش شدت پیک­ها پس از تکرار­های مونونوکلئوتیدی

4- توقف توالی ناشی از تشکیل ساختار­های ثانویه

5- نتیجه توالی یابی با وجود پرایمر تخریب شده

6- پرایمر دایمر

7- اتصال پرایمر به نواحی مختلف

8- سنتز نا­مناسب پرایمر