در حال حاضر معتبرترین شرکت سازنده دستگاههای sequencer، Applied Biosystems (ABI) میباشد و گروه زیست فن آوری پیشگام خدمات تعیین توالی به روش سنگر را به وسیله دستگاه Applied Biosystems 3500 با بالاترین کیفیت همراه با مشاوره علمی به پژوهشگران ارائه میدهد.
شکل 1: دستگاه Applied Biosystems 3500
در این مرکز، امکان خوانش قطعات تا طول 800 جفت باز و خوانش دو طرفه Forward & Reverse برای قطعات طویل و استفاده رایگان از پرایمرهای Universal موجود در آزمایشگاه که در لیست زیر ارائه شده، فراهم میباشد. علاوه بر خدمات فوق، امکان خوانش توالیهای غنی از GC به کمک پروتوکلهای اختصاصی وجود دارد. در صورتی که نتیجه تعیین توالی در مرحله اول مناسب نباشد، پس از آنالیز جوابها و بررسی کیفیت نمونهها در صورت مناسب بودن یکبار به صورت رایگان خوانش قابل تکرار است. {شرکت زیست فن آوری پیشگام از پژوهشگران محترم خواهشمند است حتما در استاندارد بودن شرایط نمونههای ارسالی (که در ذیل توضیح داده شده) حداکثر دقت را بفرمایند، لازم به ذکر است درصورت عدم رعایت نکات مذکور و به تبع نامناسب بودن جوابها پس از تکرار رایگان، شرکت مسئولیتی در قبال جوابهای دریافتی نمیپذیرد). همچنین پرایمرها و نمونههای ارسالی توسط مشتریان پس از انجام توالی یابی به مدت یک ماه در بانک مربوط نگه داری میشوند.
هزینه خدمات
* برای اطلاع از هزینه خدمات با شرکت تماس حاصل فرمایید.
شرایط لازم برای نمونهها و پرایمرهای ارسالی جهت درخواست تعیین توالی
- جدول زیر حداقل مقدار لازم و غلظت مورد نیاز را نشان میدهد. در صورت امکان، ارسال مقدار بیشتری از نمونه توصیه میگردد تا در صورت نیاز به تکرار خوانش و یا خوانش با پرایمرهای متعدد نیاز به ارسال مجدد نباشد.
|
Remarks
|
Sample Requirement
|
Template
Type/Format
|
|
For re-sequencing, at least 5 µl is required
|
* 100 ng/µl
* Minimum volume: 20 µl
|
Plasmid
|
|
N/A
|
* Agar plate/ Glycerol Stock
* gDNA: 30-50 ng
* Minimum volume: 20 µl
|
16S
|
|
For re-sequencing, at least 5 µl is required
|
* 50 ng/µl
* Minimum volume: 20 µl
|
PCR Product (Purified)
|
|
N/A
|
*> 100 ng/µl
* Minimum volume: 20 µl
|
PCR Product (Unpurified)
|
|
N/A
|
* 100 ng/µl
* Minimum volume: 20 µl
|
Difficult Sequence
|
|
Single Strand Sequencing: 1µg/ 1kb insert.
If insert size is longer than 4kb, clone is req
|
8 µg (for an insert size of up to 4kb)
|
Primer Walking
|
- لطفا نمونههای DNA در آب دیونیزه حل شود نه در سایر بافرها.
- حتما قبل از ارسال نمونه، مقدار کمی از آن را روی ژل برده و با مقایسه با نشانگر (Ladder) از اختصاصیت محصول مورد نظر مطمئن شوید (شکل 2). برای هر نمونه حداقل 25-20 میکرولیتر مورد نیاز میباشد.
شکل 2: تصویری از باندهای اختصاصی محصولات برای تعیین توالی
- توصیه میگردد همراه نمونه تصویر ژل نیز ارسال گردد (ارسال تصویر الکترونیک از طریق ایمیل شرکت نیز قابل قبول است). همکاران ما در شرکت تصاویر ژلها را بررسی نموده و وجود هر گونه مشکل در ارتباط با کیفیت و اختصاصیت محصول تکثیر شده را به مشتریان محترم اعلام میکنند.
- به طور معمول در صورت عدم تخلیص نمونهها، نتایج تعیین توالی مناسب نخواهد بود، از این رو تمامی نمونههای دریافتی توسط شرکت به روش ستونی یا با اضافه کردن آنزیم اگزو سپ تخلیص میگردند.
* منظور از تخلیص محصول PCR، حذف پرایمرها و نوکلئوتیدهای اضافی و مصرف نشده باقیمانده در هر واکنش است که وجود آنها میتواند باعث مشکلاتی در خوانشهای حاصل از دستگاه گردد.
- در مورد نمونههایی که دارای قطعات اضافی هستند (باند اضافی روی ژل)، میبایستی باند اختصاصی از ژل استخراج شده و سپس تعیین توالی گردد.
*لازم به ذکر است که تخلیص، مشکل نمونههایی که حاوی بیش از یک قطعه باشند (به عبارتی قطعات غیراختصاصی در طول تکثیر ایجاد کرده باشند) را برطرف نمیکند و در مورد این موارد میبایستی حتما ابتدا استخراج از ژل صورت گیرد.
- نیازی به ارسال پرایمرهای universal ذکر شده در جدول زیر نمیباشد. در صورت نیاز به خوانش با هر کدام از این پرایمرها نام کامل پرایمر را در ستون مربوطه ذکر نمایید. ضمنا برای جلوگیری از هر گونه اشتباه، لطفا توالی پرایمر مورد نظر را نیز ایمیل کنید.
- در مورد پرایمرهای ارسالی رعایت موارد ذیل در دستیابی به نتیجه مناسب دارای اهمیت است:
- ترجیحا پرایمرها در آب دیونیزه حل شوند.
- استوک پرایمرهای ارسالی جدید بوده و دارای خلوص بالایی باشد.
- در مورد طراحی پرایمرهای مورد استفاده برای توالی یابی، عدم اتصال غیراختصاصی و عدم وجود ساختارهای ثانویه از اهمیت بسزایی برخوردار است.
- بهتر است طول پرایمرها 2518 نوکلئوتید، با میزان GC برابر 6040 درصد و Tm برابر 6055 درجه سانتی گراد باشد.
- توصیه میگردد غلظت پرایمرهای ارسالی 10 پیکومول در میکرولیتر باشد. حجم پرایمر مورد نیاز، 15 میکرولیتر برای نمونه اول و 10 میکرولیتر برای هر نمونه اضافی میباشد.
- لطفا نام نمونهها و پرایمرها را به زبان انگلیسی و خوانا و به صورت مختصر بر روی ویالها بنویسید و دقت فرمایید که تفاوتی در نام روی ویالها با اطلاعات ذکر شده در فرم ارسالی نباشد.
- نمونهها و پرایمرها را در ویالهای یک و نیم میلی لیتری قرار داده و حتما در آنها را با پارافیم ببندید.
- فرم درخواست با فرمت Excel تهیه شده و در وب سایت شرکت موجود میباشد. ضمنا در صورت درخواست، به ایمیل شما نیز ارسال خواهد شد. پس از پر کردن فرم مذکور، خواهشمند است ضمن ارسال فرم به ایمیل شرکت، فرم را پرینت نموده و همراه نمونهها، پرایمرها و تصویر ژل به شرکت ارسال نمایید.
- تحویل نتایج به صورت ارسال به پست الکترونیک سفارش دهنده میباشد.
- در صورتی که نتیجه تعیین توالی در مرحله اول مناسب نباشد، پس از آنالیز جوابها وبررسی کیفیت نمونه ها در صورت مناسب بودن یکبار به صورت رایگان خوانش قابل تکرار است.
* در صورت نیاز به اطلاعات بیشتر با شرکت تماس حاصل فرمایید.
فهرست پرایمرهای universal موجود در آزمایشگاه
Universal Primers
|
No
|
Primer Name
|
Sequence (5'→ 3')
|
Base
|
|
1
|
Bluescript SK
|
CGCTCTAGAACTAGTGGATC
|
20
|
|
2
|
EBV-RP
|
GTGGTTTGTCCAAACTCATC
|
20
|
|
3
|
KAN2-FP
|
ACCTACAACAAAGCTCTCATCAACC
|
25
|
|
4
|
KAN2-RP
|
GCAATGTAACATCAGAGATTTTGAG
|
25
|
|
5
|
M13-FP
|
TGTAAAACGACGGCCAGT
|
18
|
|
6
|
pBacPAC-RP
|
GTCTGTAAATCAACAACGC
|
19
|
|
7
|
pBAD-FP
|
ATGCCATAGCATTTTTATCC
|
20
|
|
8
|
pDONOR-FP
|
TAACGCTAGCATGGATCTC
|
19
|
|
9
|
pEGFP_N
|
CCGTCCAGCTCGACCAG
|
17
|
|
10
|
pEGFP-FP
|
TTTAGTGAACCGTCAGATC
|
19
|
|
11
|
pEGFP-RP
|
AACAGCTCCTCGCCCTTG
|
18
|
|
12
|
pESP-RP
|
TCCAAAAGAAGTCGAGTGG
|
19
|
|
13
|
pET-24a
|
GGGTTATGCTAGTTATTGCTCAG
|
23
|
|
14
|
pET-RP
|
CTAGTTATTGCTCAGCGG
|
18
|
|
15
|
pMalE
|
TCAGACTGTCGATGAAGC
|
18
|
|
16
|
pREP-fwd
|
GCTCGATACAATAAACGCC
|
19
|
|
17
|
35S-A
|
AAGGGTCTTGCGAAGGATAG
|
20
|
|
18
|
35S-B
|
AGTGGAAAAGGAAGGTGGCT
|
20
|
|
19
|
AD Reverse
|
AGATGGTGCACGATGCACAG
|
20
|
|
20
|
CYC1 Reverse
|
GCGTGAATGTAAGCGTGAC
|
19
|
|
21
|
DsRed1-C
|
AGCTGGACATCACCTCCCACAACG
|
24
|
|
22
|
DsRed1-N
|
GTACTGGAACTGGGGGGACAG
|
21
|
|
23
|
EGFP-C
|
CATGGTCCTGCTGGAGTTCGTG
|
22
|
|
24
|
EGFP-N
|
CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG
|
22
|
|
25
|
GAL1 Forward
|
AATATACCTCTATACTTTAACGTC
|
24
|
|
26
|
U-19mer Primer
|
GTTTTCCCAGTCACGACGT
|
19
|
|
27
|
T7 EEV
|
ATGTCGTAATAACCCCGCCCCG
|
22
|
|
28
|
Bluescript KS
|
TCGAGGTCGACGGTATC
|
17
|
|
29
|
pFastBac Forward
|
GGATTATTCATACCGTCCCA
|
20
|
|
30
|
pFastBac Reverse
|
CAAATGTGGTATGGCTGATT
|
20
|
|
31
|
AOX1 Forward
|
GACTGGTTCCAATTGACAAGC
|
21
|
|
32
|
AOX1 Reverse
|
GCAAATGGCATTCTGACATCC
|
21
|
|
33
|
a-Factor
|
TACTATTGCCAGCATTGCTGC
|
21
|
|
34
|
STag 18mer Primer
|
GAACGCCAGCACATGGAC
|
18
|
|
35
|
MT Forward
|
CATCTCAGTGCAACTAAA
|
18
|
|
36
|
QE Promoter
|
CCGAAAAGTGCCACCTG
|
17
|
|
37
|
pRH Forward
|
CTGTCTCTATACTCCCCTATAG
|
22
|
|
38
|
pRH Reverse
|
CAAAATTCAATAGTTACTATCGC
|
23
|
|
39
|
SV40-pArev
|
CCTCTACAAATGTGGTATGG
|
20
|
|
40
|
SV40-Promoter
|
GCCCCTAACTCCGCCCATCC
|
20
|
|
41
|
pTrcHis Forward
|
GAGGTATATATTAATGTATCG
|
21
|
|
42
|
ITS1
|
TCCGTAGGTGAACCTGCGG
|
19
|
|
43
|
ITS2
|
GCTGCGTTCTTCATCGATGC
|
20
|
|
44
|
ITS3
|
GCATCGATGAAGAACGCAGC
|
20
|
|
45
|
ITS4
|
TCCTCCGCTTATTGATATGC
|
20
|
|
46
|
ITS5
|
GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG
|
22
|
|
47
|
pJET1.2F
|
CGACTCACTATAGGGAGAGCGGC
|
23
|
|
48
|
pJET1.2R
|
AAGAACATCGATTTTCCATGGCAG
|
24
|
|
49
|
T7
|
AATACGACTCACTATAG
|
17
|
|
50
|
T7terminator
|
GCTAGTTATTGCTCAGCGG
|
19
|
|
51
|
T7promoter
|
TAATACGACTCACTATAGGG
|
20
|
|
52
|
T3
|
ATTAACCCTCACTAAAG
|
17
|
|
53
|
SP6
|
ATTTAGGTGACACTATAG
|
18
|
|
54
|
M13F-pUC(-40)
|
GTTTTCCCAGTCACGAC
|
17
|
|
55
|
M13R-pUC(-40)
|
CAGGAAACAGCTATGAC
|
17
|
|
56
|
M13F
|
GTAAAACGACGGCCAGT
|
17
|
|
57
|
M13R
|
GCGGATAACAATTTCACACAGG
|
22
|
|
58
|
pGEX5
|
GGCAAGCCACGTTTGGTG
|
18
|
|
59
|
pGEX3
|
GGAGCTGCATGTGTCAGAGG
|
20
|
|
60
|
27F
|
AGAGTTTGATCMTGGCTCAG
|
20
|
|
61
|
1492R
|
TACGGYTACCTTGTTACGACTT
|
22
|
|
62
|
518F
|
CCAGCAGCCGCGGTAATACG
|
20
|
|
63
|
800R
|
TACCAGGGTATCTAATCC
|
18
|
|
64
|
BGH-R
|
TAGAAGGCACAGTCGAGG
|
18
|
|
65
|
CMV-F
|
CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG
|
21
|
|
66
|
RVprimer3
|
CTAGCAAAATAGGCTGTCCC
|
20
|
|
67
|
RVprimer4
|
GACGATAGTCATGCCCCGCG
|
20
|
|
68
|
GLprimer1
|
TGTATCTTATGGTACTGTAACTG
|
23
|
|
69
|
GLprimer2
|
CTTTATGTTTTTGGCGTCTTCCA
|
23
|
|
70
|
pQE-F
|
CCCGAAAAGTGCCACCTG
|
18
|
|
71
|
pQE-R
|
GTTCTGAGGTCATTACTGG
|
19
|
|
72
|
Gal4AD
|
TACCACTACAATGGATG
|
17
|
|
73
|
pBAD-F
|
ATGCCATAGCATTTTTATCCA
|
21
|
|
74
|
pBAD-R
|
GATTTAATCTGTATCAGG
|
18
|
|
75
|
EGFP-CF
|
AGCACCCAGTCCGCCCTGAGC
|
21
|
|
76
|
EGFP-CR
|
CGTCCATGCCGAGAGTG
|
17
|
|
77
|
EGFP-NR
|
CGTCGCCGTCCAGCTC
|
16
|
|
78
|
LCO1490
|
GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG
|
25
|
|
79
|
HCO2198
|
TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA
|
26
|
|
80
|
785F
|
GGATTAGATACCCTGGTA
|
18
|
|
81
|
907R
|
CCGTCAATTCMTTTRAGTTT
|
20
|
|
82
|
337F
|
GACTCCTACGGGAGGCWGCAG
|
21
|
|
83
|
1100R
|
GGGTTGCGCTCGTTG
|
15
|
|
84
|
NS1
|
GTAGTCATATGCTTGTCTC
|
19
|
|
85
|
NS8
|
TCCGCAGGTTCACCTACGGA
|
20
|
|
86
|
LR0R
|
ACCCGCTGAACTTAAGC
|
17
|
|
87
|
LR7
|
TACTACCACCAAGATCT
|
17
|
